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https://www.nature.com/articles/s41467-023-44169-z

为了探究组合重复寡肽结构域的功能，研究团队首先在枯草芽孢杆菌系统中表达了全长和组合重复寡肽缺失的TcsL蛋白。期间团队成员发现了一个有趣的现象：组合重复寡肽缺失的TcsL在蛋白纯化过程中会自发进行切割。通过质谱分析和突变实验证实切割位点位于543位的亮氨酸和544位的甘氨酸，这是TcsL中的半胱氨酸蛋白酶的自剪切位点。在全长蛋白中，需要较高浓度的六磷酸肌醇（InsP6）才能激活半胱氨酸蛋白酶的自切割活性，这说明缺失组合重复寡肽结构会造成TcsL中的半胱氨酸蛋白酶活性失控变得过度活跃（图2）。

为了进一步分析组合重复寡肽区域中抑制半胱氨酸蛋白酶活性的序列位点，研究者们构建了一系列毒素的截短和突变体，通过InsP6诱导的体外酶切实验，发现不同长度的组合重复寡肽片段对半胱氨酸蛋白酶的活性有着不同程度的影响。更有趣的是，缺失了组合重复寡肽的TcsL在细胞上的毒性甚至高于全长TcsL，说明该结构区域还影响了毒素的细胞毒性（图3）。

之后，陶亮团队与施一公团队开展合作，利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了在中性条件下和酸性条件下TcsL全长蛋白的三维结构。研究者发现，在中性条件下，TcsL呈现一种开放式的构象；而在酸性条件下，组合重复寡肽区域会发生近180°的旋转，形成一种关闭式的构象。其中关闭式的构象中，组合重复寡肽区域与其它结构域之间产生了两个分子内的互作界面，从而牢牢地“锁住”了毒素的其它区域（图4）。

接下来，研究者们模拟了TcsL释放到环境中，之后再接触宿主的情形。利用小鼠攻毒模型结合病理分析，研究者发现缺少组合重复寡肽区域的TcsL在存在InsP6的环境中暴露仅仅20分钟即会完全失活，这对于一种外毒素来说是不可接受的缺点。而全长的TcsL在类似环境下30分钟也不会有任何活性损失（图5）。最后，研究者们还将这一规律在大梭菌毒素家族的其他成员，包括TcdA，TcdB，TcsH和Tcnα中进行了验证，发现它们的组合重复寡肽区域也有着类似的作用。

基于上述发现，研究者们提出了一种组合重复寡肽区域调控TcsL及其它大梭菌毒素稳定性和毒性的模型（图6）。作为一类外毒素，TcsL在被细菌释放到胞外后将面临各种复杂的环境条件。毒素可能以开放和关闭两种构象存在，其中开放式构象的组合重复寡肽区域舒展，暴露出毒素的核心区，这种构象对于攻击宿主细胞更为有利。而在一些相对严厉的条件下（如低pH值等），毒素倾向于转变为关闭式的构象，这种构象分子结构更为紧密和牢固，不易发生自剪切和降解。这种构象更利于维持毒素的稳定性和活性，直至毒素分子接触到其目标宿主细胞。