走近西湖大学陶亮团队：探索疾病潜在疗法新策略

诺氏梭状芽胞杆菌（C. novyi）是一种形成孢子的厌氧细菌和机会性病原体，可在人和动物中引起严重的传染病，包括气性坏疽，肌炎，坏死性肝炎和败血症。 α毒素（Tcnα）是诺氏梭状芽胞杆菌的主要毒力因子，由所有已知的致病性诺维梭菌产生。但是，Tcnα的宿主受体尚不清楚。

2021年5月10日，西湖大学陶亮团队在Cell Research 在线发表题为“Sulfated glycosaminoglycans and low-density lipoprotein receptor mediate the cellular entry of Clostridium novyi alpha-toxin”的研究论文，该研究通过CRISPR / Cas9介导的KO筛选确定了硫酸化的糖胺聚糖是Tcnα的关键附着因子。 硫酸糖胺聚糖普遍存在于细胞表面，因此可作为各种传染原（包括引起全球大流行的新兴病毒SARS-COV-2）的理想着陆点。

该研究进一步揭示了硫酸糖胺聚糖与LDLR家族成员之间的协同作用有助于Tcnα的进入。 最后，该研究证明了硫酸化的糖胺聚糖是体内Tcnα引起的肌病的关键附着因子，SCD在小鼠模型中有效减少了由Tcnα引起的组织损伤。 这些发现表明，阻断Tcnα和硫酸化的糖胺聚糖之间的相互作用可能是开发针对Tcnα诱导的疾病的潜在疗法的新策略。

诺氏梭状芽胞杆菌（C. novyi）是一种形成孢子的厌氧细菌和机会性病原体，可在人和动物中引起严重的传染病，包括气性坏疽，肌炎，坏死性肝炎和败血症。α毒素（Tcnα）是诺氏梭状芽胞杆菌的主要毒力因子，由所有已知的致病性诺维梭菌产生。

Tcnα属于大型梭菌毒素（LCT）家族，其中还包括艰难梭菌毒素A（TcdA），毒素B（TcdB），索氏青枯菌致死性毒素（TcsL），出血性毒素（TcsH）以及产气荚膜梭菌大细胞毒素（TpeL）。像其他LCT一样，Tcnα结合到靶细胞的表面，并通过受体介导的内吞作用进入细胞。然后将酶促结构域递送到细胞质中，并使用UDP-N-乙酰氨基葡糖作为共底物将小Rho家族的GTPases，从而导致细胞骨架破坏和细胞死亡。最近，包括TpeL，TcdB，TcdA和TcsL在内的几种LCT的细胞受体已被鉴定。Tcnα和TcsH是LCT家族中仅有的两个主要成员，其宿主受体尚不清楚。

为了鉴定Tcnα的潜在受体，该研究进行了全基因组CRISPR / Cas9介导的敲除（KO）筛选。用慢病毒单向导RNA（sgRNA）文库（GeCKO v2）转导稳定表达Cas9的HeLa细胞，并用Tcnα进行三轮选择 。来自存活细胞的sgRNA的下一代测序表明，排名最高的五个富集基因中的四个（包括B4GALT7，B3GALT6，EXT1和SLC35B2）编码参与硫酸乙酰肝素生物合成的酶。硫酸乙酰肝素生物合成途径中的其他几种编码酶的基因，例如B3GAT3，EXT2，HS6ST3和EXTL3，也在筛选中大大丰富（> 10倍）。

为了验证硫酸乙酰肝素在Tcnα细胞结合/进入中的作用，该研究通过CRISPR / Cas9生成了 EXT1 ‒ / ‒，EXT2 ‒ / ‒，EXTL3 ‒ / ‒，B4GALT7 ‒ / ‒和SLC35B2 ‒ / ‒ HeLa细胞。与WT细胞相比，所有这些KO细胞均表现出对Tcnα的增加的抗性。硫酸乙酰肝素通常以硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的形式锚定在核心蛋白上，并且在各种细胞类型中含量丰富，因此可以作为Tcnα的通用细胞表面附着因子。该研究用荧光染料若丹明标记了Tcnα，然后检查了它与HeLa细胞的表面结合。正如预期的那样，与WT细胞相比，EXT1‒/‒ 和SLC35B2‒/‒  HeLa细胞均显示Tcnα的表面结合大大降低。

在以上测试的KO细胞中，B4GALT7‒/‒和SLC35B2‒/‒ HeLa 细胞表现出对Tcnα的特别高的抵抗力（> 30倍）。与仅催化硫酸乙酰肝素生物合成的EXT1，EXT2和EXTL3不同，B4GALT7和SLC35B2参与了各种硫酸化聚糖的生物合成。B4GALT7催化糖胺聚糖侧链合成的启动，SLC35B2将硫酸盐供体腺苷3'-磷酸-5'-磷酸硫酸盐（PAPS）从胞质溶胶转运到高尔基体。为了检查Tcnα是否也可以识别其他硫酸化的糖胺聚糖，该研究使用与硫酸乙酰肝素结构相关的一组聚糖进行了竞争测定。Tcnα与硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，肝素，硫酸葡聚糖和硫酸化α-环糊精（SCD）的预孵育均降低了细胞的圆化水平，而透明质酸（非硫酸化糖胺聚糖）则没有抑制作用。一致地，用中和硫酸化糖胺聚糖负电荷的小分子surfen对细胞进行预处理，可以保护HeLa细胞免受Tcnα的侵害。这些结果表明，Tcnα可以识别硫酸化的聚糖，而带负电荷的硫酸化基团对于相互作用至关重要。

总之，该研究通过CRISPR / Cas9介导的KO筛选确定了硫酸化的糖胺聚糖是Tcnα的关键附着因子。硫酸糖胺聚糖普遍存在于细胞表面，因此可作为各种传染原（包括引起全球大流行的新兴病毒SARS-COV-2）的理想着陆点。该研究进一步揭示了硫酸糖胺聚糖与LDLR家族 成员之间的协同作用有助于Tcnα的进入。最后，该研究证明了硫酸化的糖胺聚糖是体内Tcnα引起的肌病的关键附着因子，SCD在小鼠模型中有效减少了由Tcnα引起的组织损伤。这些发现表明，阻断Tcnα和硫酸化的糖胺聚糖之间的相互作用可能是开发针对Tcnα诱导的疾病的潜在疗法的新策略。

参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41422-021-00510-z

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